LINKS: Proben für die chemische Untersuchung: Die in Gläsern eingefrorenen Proben (Bienen, Pflanzen, Bienenbrot, Futter) werden bis zur Analyse tiefgekühlt bei ca. - 20°C gelagert.
RECHTS: Einwaage einer Bienenprobe: Die Vorgehensweise bei der Einwaage richtet sich nach dem zu analysierenden Material. Für jede Rückstandsanalyse werden 100 Bienen benötigt. Dafür werden 10 Bienen abgewogen und das Gewicht von 100 Bienen wird errechnet. Das pflanzliche Material wird komplett grob zerkleinert, bevor für die Analyse 10 g eingewogen werden.

Zerkleinerung und Extraktion einer Rapsprobe: Die Analysenprobe wird in ein Zentrifugenglas gegeben und mit einem für die Extraktion der gesuchten Wirkstoffe geeigneten Lösungsmittelgemisch (Aceton/Wasser) sowie dem Kontrollstandard (Surrogat) versetzt. Nach einer Einwirkzeit von 30 min wird jede Probe 3 min mit einem Dispergierstab (Zerkleinerungsgerät) homogenisiert. Der Kontrollstandard wird dazu benötigt, die Qualität der gesamten Analyse zu beurteilen.

Zentrifugieren und Flüssigextraktion mit ChemElut-Kartuschen: Der homogenisierte Rohextrakt wird zur Abtrennung fester, ungelöster Bestandteile zentrifugiert. Von der klaren, über dem Bodensatz stehenden Lösung wird ein genau abgemessener Teil auf eine ChemElut-Kartusche gegeben. ChemElut ist der Name für mit Diatomeenerde (=Kieselgur) gefüllte Kartuschen, die als Ersatz für die klassische Flüssig-Flüssig-Extraktion verwendet werden. Die zugegebene Flüssigkeit wird von der Diatomeenerde komplett aufgenommen. Nach einer Einwirkzeit von 15 min werden die Analyten mit einem organischen Lösungsmittel (Dichlormethan) eluiert, das mit Wasser nicht mischbar ist. Je besser die Analyten im Lösungsmittel löslich sind und je schlechter in Wasser, umso höher ist die Ausbeute der Extraktion.

Filtration zur Herstellung der Messlösungen: Die im Rundkolben über den ausgefrorenen Begleitstoffen befindliche Lösung wird zügig mit einer Spritze aufgezogen und über einen Spritzenfilter (0,2 µm) in ein Probenfläschchen filtriert. Ein Teil des konzentrierten Probenextrakts wird für die insgesamt fünf chromatographisch-massenspektrometrischen Messungen mit LC-MS/MS und GC-MS abgefüllt.

Chromatographisch-massenspektrometrische Messgeräte: Zur Erfassung aller Wirkstoffe, die auf der Screeningliste stehen, müssen mit zwei verschiedenen Messgeräten insgesamt fünf Messungen durchgeführt werden. In der linken Abbildung sieht man das GC-MS-Gerät ISQ 7000 [Negative Chemische Ionisation (NICI) und Elektronenstoß-Ionisation (EI)]. In der rechten Abbildung sieht man das LC-MS/MS-Gerät 4000 QTRAP [Elektrospray Ionisation (ESI) positiv und negativ].

Auswertung der GC-MS-Messergebnisse: Abbildung 1 ist eine Übersicht aller in einer Bienenprobe gesuchten 59 Substanzen und 7 internen Standards (IS). Deutlich erkennbar sind die Signale (Peaks) der internen Standards, der nachgewiesenen Pyrethrine und des Tetramethrins (grün ausgemalt). Die Abbildungen 2a und 2b zeigen die Signale der für die Identifizierung und Quantifizierung erforderlichen Fragmente des Tetramethrins (Qualifier und Quantifier Ion). Die Signalfläche des Quantifier-Fragments wird für die Quantifizierung herangezogen. Daneben (Abb. 3a/3b) sind die kompletten (Full Scan-) Massenspektren der Probe (1:10 verdünnter Extrakt) und eines Matrixstandards zu sehen. Der Spektrenvergleich dient der erweiterten Absicherung des Nachweises.

Auswertung der LC-MS/MS-Messergebnisse: Das Chromatogramm in Abbildung A zeigt die Signale aller in der Probe mit dieser Methode messbaren Substanzen (Messzeit: 22 Minuten).
In den Extrakten der Proben wird nach vor der Messung festgelegten Zielsubstanzen (Analyten) anhand charakteristischer Massenübergänge (MRM = Multiple Reaction Monitoring) „gefahndet". Gefunden werden kann nur, was gesucht wird! In Abbildung B ist das Chromatogramm einer Bienenprobe mit den drei MRM-Übergängen diverser interner Standards und einiger nachgewiesener Wirkstoffe zu sehen. Das Chromatogramm in Abbildung C zeigt nur die jeweils drei gemessenen MRM-Übergänge für die in der Bienenprobe nachgewiesenen Wirkstoffe Thiacloprid (1), Myclobutanil (2), Fluopyram (3), Trifloxystrobin (4), Cyprodinil (5) und Difenoconazol (6).